在Neuroscience Letters發(fā)文揭示法舒地爾對髓鞘保護和再生的新機制
多發(fā)性硬化（MS）是一種自身免疫炎癥反應介導的中樞神經系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病。發(fā)病過程主要包括外周免疫細胞浸潤CNS,，引發(fā)少突膠質細胞（OLs）死亡,，最終導致神經元的髓鞘脫失和軸突變性。髓鞘再生被認為是治療脫髓鞘疾病的關鍵因素,，且髓鞘再生的增強與神經功能的恢復密切相關,。大量研究表明，髓鞘再生可逆轉神經元軸突的損傷,，使臨床癥狀得到恢復,。影響髓鞘再生的因素主要包括清除損傷區(qū)域的髓鞘碎片，產生促進髓鞘再生的因子,，以及加速少突膠質前體細胞（OPCs）向成熟的OLs轉化過程,。髓鞘碎片在病變周圍聚集,，不僅會引發(fā)炎癥反應，還會抑制髓鞘在CNS中的形成,。因此,，在髓鞘形成過程中清除髓鞘碎片是十分必要的。研究表明,，小膠質細胞在髓鞘再生過程中扮演著重要角色,。小膠質細胞不僅吞噬髓鞘碎片，減輕炎癥反應,，還可在清除髓鞘碎片的過程中產生再生因子,，加速髓鞘再生。Cuprizone（CPZ）模型作為研究髓鞘再生的動物模型,，病理表現出廣泛的髓鞘碎片聚集和小膠質細胞的激活,。目前，雖然一些免疫調節(jié)藥物已被證明對MS有效,，但仍缺乏促進髓鞘再生的有效性證據,。法舒地爾作為一種典型的Rho激酶抑制劑，在脫髓鞘疾病中表現出多種優(yōu)勢,。一系列研究表明,，法舒地爾可能通過抑制神經炎癥、激活神經干細胞和促進神經軸突再生,，進而發(fā)揮CNS保護功能,。先前課題組研究表明，法舒地爾通過影響小膠質細胞的表型轉化發(fā)揮髓鞘保護的作用,。因此,，法舒地爾促進MS的髓鞘再生機制需要進一步闡明。
2021年4月7日,，山西醫(yī)科大學附屬白求恩醫(yī)院李新毅和馬存根課題組在Neuroscience Letters上發(fā)表了題為“Fasudil enhances the phagocytosis of myelin debris and the expression of neurotrophic factors in cuprizone-induced demyelinating mice.”的研究論文,。該研究從上述問題出發(fā)，在體內外觀察法舒地爾對小膠質細胞吞噬髓鞘碎片的影響,。此外,，進一步觀察吞噬髓鞘碎片的小膠質細胞神經營養(yǎng)因子的分泌及對髓鞘再生的影響。
該研究的主要結果有：
1.法舒地爾體外促進小膠質細胞吞噬髓鞘碎片
課題組首先篩選了法舒地爾誘導小膠質細胞吞噬熒光髓鞘碎片（FMD）的最佳濃度和時間,，發(fā)現15 μg/ml法舒地爾作用48 h可增強小膠質細胞對髓鞘碎片的吞噬作用,，表明法舒地爾的作用濃度和吞噬時間適合后續(xù)研究。通過體外實驗,，課題組發(fā)現法舒地爾能夠上調TREM2/DAP12通路mRNA和蛋白的表達（圖1）,。
2. 法舒地爾體外誘導小膠質細胞表達神經營養(yǎng)因子
進一步發(fā)現，法舒地爾能夠增強吞噬碎片的小膠質細胞高表達BDNF和GDNF,，提示體外小膠質細胞吞噬髓鞘碎片可能上調BDNF和GDNF的表達（圖2）,。進一步收集PBS（M0）,、法舒地爾（M1）、FMD/PBS（M2）或FMD/法舒地爾（M3）干預BV-2小膠質細胞的條件培養(yǎng)液（CMs）,，孵育OPCs 9天,，發(fā)現FMD/法舒地爾組CMs干預后OPCs的MBP染色明顯增強，多極分支明顯（圖3）,。
綜上所述,，法舒地爾促進小膠質細胞攝取FMD，刺激BDNF和GDNF的表達,，促進OPCs體外成熟,。
3. 法舒地爾在體內促進小膠質細胞吞噬髓鞘碎片
通過腦立體定位注射FMD證實了法舒地爾可促進CPZ誘導脫髓鞘模型吞噬清除外源性髓鞘碎片（圖4）。進一步通過免疫熒光染色發(fā)現小膠質細胞和髓鞘存在共定位關系,，提示髓鞘的破壞導致小膠質細胞的富集和髓鞘碎片的吞噬（圖5）,。
4. 法舒地爾誘導體內神經營養(yǎng)因子的表達，再生髓鞘
通過免疫熒光染色和western blot分析發(fā)現,，法舒地爾能夠明顯上調小膠質細胞BDNF和GDNF的表達,，這與我們體外實驗結果相一致（圖6）。同時發(fā)現,，法舒地爾干預可增加OPCs標志物（Oligo2,，PDGFRα）和OLs標志物（MBP）的表達，提示法舒地爾促進CPZ誘導的脫髓鞘小鼠OPCs的形成和成熟,。
山西醫(yī)科大學附屬白求恩醫(yī)院博士生丁智斌為該論文第一作者,，李新毅、馬存根和肖保國為該論文的共同通信作者,。該研究得到了國家自然科學基金,、山西省應用基礎研究項目、山西省國際科技合作項目,、山西省留學基金委科研項目等多方資助,。
圖1 法舒地爾誘導BV-2小膠質細胞吞噬髓鞘碎片
圖2 法舒地爾上調FMD吞噬的BV-2細胞BDNF和GDNF的表達
圖3 髓鞘碎片/法舒地爾組BV-2細胞CMs促進OPCs成熟
圖4 法舒地爾促進小膠質細胞清除CPZ小鼠腦內外源性髓鞘碎片
圖5 法舒地爾誘導CPZ小鼠腦小膠質細胞表達BDNF和GDNF
圖6 法舒地爾可促進OPCs的體內再生和分化
