實(shí)驗(yàn)動物中心王春芳課題組發(fā)現(xiàn)調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵microRNA分子
2021年6月11日，實(shí)驗(yàn)動物中心王春芳課題組在Experimental Biology and Medicine發(fā)表體味“miR-31 promotes neural stem cell proliferation and restores motor function after spinal cord injury injury”的研究論文,，發(fā)現(xiàn)了在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中,，敲降miR-31的表達(dá)后，斑馬魚的側(cè)索神經(jīng)元不發(fā)育,，并伴有大量的凋亡顆粒,，喪失運(yùn)動功能。
脊髓損傷后的神經(jīng)再生及突觸連接一直是治療脊髓損傷的難點(diǎn)?，F(xiàn)有研究證實(shí)在脊髓損傷后局部注射神經(jīng)干細(xì)胞可以有效恢復(fù)損傷后的運(yùn)動和感覺功能1,。但神經(jīng)干細(xì)胞的獲得和使用收到倫理學(xué)的限制。而在課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn),，miR-31在神經(jīng)干細(xì)胞高表達(dá)在運(yùn)動神經(jīng)元低表達(dá)2,。對miR-31進(jìn)行生物信息學(xué)分析的研究也顯示，miR-31在物種間高度保守，由此推測miR-31可能在NSCs的分化過程中起著重要重要作用,。同時,，Liu等也發(fā)現(xiàn)，在SCI后,，miR-31表達(dá)增高3,，說明miR-31在SCI的修復(fù)過程中起著一定作用。Xu的實(shí)驗(yàn)說明脊髓結(jié)扎后的3天,、7天和13天血清中miR-31的表達(dá)升高4,，HL Chang證實(shí)在SNL、DRT和VRT損傷7天后DGR神經(jīng)元的miR-31的表達(dá)上調(diào)5,。但miR-31具體的治療機(jī)制及在神經(jīng)發(fā)育中的具體作用未知,。
為了研究miR-31調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的具體作用和相關(guān)機(jī)制，王春芳課題組先通過生物信息學(xué)分析,，預(yù)測miR-31是否會對神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生作用,。證實(shí)后，在HB9:EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的基礎(chǔ)上,，構(gòu)建了斑馬魚的miR-31敲降模型,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31敲降后斑馬魚的脊索及側(cè)索發(fā)育異常，MNs數(shù)量減少,，斑馬魚喪失運(yùn)動功能,。同時，AO染色顯示在miR-31 MO斑馬魚的中樞神經(jīng)部位和尾部出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,，但在側(cè)索部位未出現(xiàn)凋亡顆粒,。
圖1-1 Morpholino敲降miR-31表達(dá)后導(dǎo)致斑馬魚MNs發(fā)育異常。
斑馬魚胚胎注射了8ng miR-31 MO或8ng Standard Control后MNs的生長發(fā)育狀況（A-H）,。熒光顯微鏡下可以觀察到48 hpf時的斑馬魚軀干部位的MNs（白色箭頭）的及其結(jié)構(gòu),，在Standard Control組可以發(fā)現(xiàn)脊索和側(cè)索正常發(fā)育（B-D）。而在miR-31 MO組,，發(fā)現(xiàn)脊索熒光強(qiáng)度較Standard Control組低，側(cè)索無法觀察到,，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常（F-H）,。同時逃逸反應(yīng)顯示48 hpf的miR-31 MO組斑馬魚無反應(yīng)。
圖2軟件分析對比miR-31MO組和Standard Control組斑馬魚脊髓部位出現(xiàn)凋亡顆粒的情況,。
為了驗(yàn)證MNs缺失是否由凋亡引起,，我們使用AO評估斑馬魚在26 hpf時的細(xì)胞凋亡情況。對照組與miR-31 MO組比較發(fā)現(xiàn),，對照組中僅有少量凋亡顆粒,，而miR-31 MO組則有大量凋亡顆粒沿中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊索呈線性分布。此外，側(cè)區(qū)凋亡顆粒相對較脊索部小,。Image J定量分析了miR-31 MO與對照組的凋亡顆粒數(shù)量,，發(fā)現(xiàn)miR-31 MO的平均凋亡顆粒數(shù)量為125.9個，而對照組為5個,，差異為25倍,。這些結(jié)果表明，miR-31敲降后,，斑馬魚的脊髓部位在神經(jīng)元缺失的情況下,，同時出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，側(cè)索未形成,，斑馬魚失去運(yùn)動功能,。
NSCs對神經(jīng)系統(tǒng)的注射治療正越來越受到人們的關(guān)注，但是如何獲取NSCs是困擾人們的難題,。綜合以上實(shí)驗(yàn),，我們推測miR-31可以促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的存活和增殖。對于需要注射NSCs進(jìn)行治療的SCI患者或其他中樞神經(jīng)受損的病人,，可以在體外合成miR-31 agomir,，注射至體內(nèi)，促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化,，用于治療神經(jīng)損傷類疾病,，避免諸多麻煩。
1. Piltti KM, Funes GM, Avakian SN, et al. Increasing Human Neural Stem Cell Transplantation Dose Alters Oligodendroglial and Neuronal Differentiation after Spinal Cord Injury. Stem Cell Reports 2017;8:1534-48.
2. Wei H, Wang C, Zhang C, Li P, Wang F, Zhang Z. Comparative profiling of microRNA expression between neural stem cells and motor neurons in embryonic spinal cord in rat. Int J Dev Neurosci 2010;28:545-51.
3. Liu NK, Wang XF, Lu QB, Xu XM. Altered microRNA expression following traumatic spinal cord injury. Exp Neurol 2009;219:424-9.
4. Xu Y, Zhang X, Pu S, Wu J, Lv Y, Du D. Circulating microRNA expression profile: a novel potential predictor for chronic nervous lesions.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(英文) 2014;46:942.
5. Chang HL, Wang HC, Chunag YT, et al. miRNA Expression Change in Dorsal Root Ganglia After Peripheral Nerve Injury. Journal of Molecular Neuroscience 2017;61:169-77.
