山西醫(yī)科大學(xué)二院張永紅團隊揭示骨髓間充質(zhì)干細胞來源囊泡中microRNA-335促進骨折恢復(fù)作用機制研究
目前，骨組織修復(fù)及自愈的機制尚未得到完全的揭示，越來越多的研究轉(zhuǎn)向有促進組織修復(fù)及再生能力的干細胞來源的囊泡中,，其中囊泡中miRNA作為一種良好的生物標志物在疾病進展及疾病治療中發(fā)揮了巨大的作用，也引起了極大的關(guān)注,，但是并沒有太多的基礎(chǔ)研究聚焦在外泌體促進骨折恢復(fù)的機制研究上
2021年2月4號山西醫(yī)科大學(xué)二院張永紅團隊在雜志《Cell Death and Disease》上正式發(fā)表題目為“Role of microRNA-335 carried by bone marrow mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles in bone fracture recovery”的研究論文，闡述了骨髓間充質(zhì)干細胞來源囊泡中microRNA-335通過VapB和Wnt/β-catenin通路促進骨折恢復(fù)作用機制,。
第一部分：構(gòu)建小鼠骨折模型,、培養(yǎng)骨髓間充干細胞（BMMSCs）分離及鑒定胞外囊泡（EVs）。1.研究使用C57BL/6小鼠以及實驗室改造完成并正常繁育飼養(yǎng)的C57BL/6 CD9-/-遺傳型小鼠進行構(gòu)建骨折模型,；所用細胞為小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,，BMMSCs）。2. 從培養(yǎng)4-6代的BMMSCs中提取B-EVs,，通過透射電鏡,、Western Blot以及納米粒徑分析儀鑒定E-BVs的形態(tài)、特異性蛋白（CD11b、CD 45,、CD29以及CD90）的表達情況以及粒徑大?。?. 野生型（wild type,，WT)和CD9-/- C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三點彎曲產(chǎn)生橫向股骨干骨折,，在建模結(jié)束后的0、1,、2,、3、4周,，對小鼠骨折模型骨愈合情況進行分析,，通過高分辨SKYSCAN進行活體顯微影像學(xué)分析、計算機斷層掃描骨密度等進行分析,，驗證小鼠骨折模型,。
BM-MSCs細胞中提取EVs，通過納米粒徑分析,、透射電鏡分析及Western Blot分析結(jié)果證明分離得到的B-EVs的正確性,，可以用于后續(xù)研究；兩組小鼠在建模前即可檢測時,，野生型小鼠的體重和骨密度無顯著差異,，CD9-/-小鼠脛骨生長板的寬度顯著減少，野生型小鼠在骨折后2周通過骨痂形成表現(xiàn)出軟骨內(nèi)骨化,， 3周時骨愈合明顯,，與野生型小鼠相比，CD9-/-小鼠表現(xiàn)出骨折愈合的顯著延遲,。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率為25%，明顯低于野生型小鼠,，表明與野生型小鼠相比,，CD9-/-小鼠的愈合能力下降；
A：EVs分離純化的步驟,；B：透射電鏡檢測EV的形態(tài),；C：NTA檢測EVs的大小及分布情況；E：western blot檢測EVs的特異性蛋白
兩組小鼠CD9-/-小鼠骨折愈合受損情況分析
（A） X射線檢測骨愈合率,；（B）骨愈合率檢測兩組小鼠的骨愈合情況,；
（C）骨折后2周和3周切取WT和CD9-/-小鼠股骨，用H&E染色,；比例尺= 100 μm
第二部分：EVs干預(yù)下骨折小鼠模型中差異miRNA的鑒定,。1.分組：對構(gòu)建的小鼠模型進行分組，分別為WT + NC組（GW4869干預(yù)后，EV-NC注射的WT小鼠）,、WT + EVs組（注射B-EVs的WT小鼠）,、WT + EVs-Mock組（注射B-EVs的WT小鼠預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑NC）、WT + EVs-Inhibitor組（WT小鼠注射B-EVs預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335 Inhibitor）,；CD9-/-小鼠分別分為：CD9-/-+ NC組（CD9-/-小鼠注射GW4869干預(yù)后的EV-NC）,、CD9-/-+ B-EVs組（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+ EVs-Mock組（CD9-/-小鼠注射B-EVs預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335 Inhibitor NC）,、CD9-/-+ EVs-Inhibitor組（CD9-/-小鼠注射B-EVs前轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑）,。2.EVs的注射時間及劑量：各組小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100 μL或外泌體抑制劑GW4869作用下的EV-NC 100 μL；3.使用pCDH質(zhì)粒通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立過表達miR-335-inhibtor和 EVs-Inhibitor的穩(wěn)定骨細胞系,；4. 骨折建模后2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨,，將組織在4%緩沖多聚甲醛中固定48 h，隨后用緩沖EDTA進行脫鈣處理,。5. 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,，IHC）檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2),；6. RT-qPCR檢測差異表達miRNA的表達水平,；7. 放射免疫沉淀試驗分析提取總蛋白；8. 微陣列檢測差異表達3只WT + PBS治療的小鼠和3只WT + B-EV治療的小鼠miRNA,；9. 通過SPSS21.0進行統(tǒng)計分析,。
本部分實驗顯示：B-EV處理促進了成骨細胞的分化和骨折的恢復(fù)；EVs對CD9-/-小鼠的治療作用明顯低于WT小鼠,； 與WT小鼠相比,，EV處理后的CD9-/-小鼠軟骨組織中73個miRNA下調(diào)，104個miRNA上調(diào),，挑選差異表達最顯著的miR-335,、miR-136、miR-125a,、miR-217,、miR-487a、miR-339,、miR-298和miR-133a進行后續(xù)實驗,； EvimiRNA在線預(yù)測網(wǎng)站上分析miR-335的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn),，miR-335在骨髓間充質(zhì)干細胞中含量豐富,，我們推測miR-335可能在骨折的修復(fù)中發(fā)揮作用。外泌體抑制劑GW4869對B-EVs的分泌無明顯影響,；5. HE染色,、甲苯胺藍染色及BMP2免疫組化結(jié)果顯示B-EV中miR-335對小鼠骨折恢復(fù)具有促進作用,；
放射學(xué)及HE染色檢測EV治療后第0周、1周,、2周,、4周骨折小鼠的恢復(fù)情況
（A,B）骨折小鼠的X射線檢測結(jié)果，骨愈合評分,；（C）骨折建模后2周,，切除小鼠股骨，進行HE和苯胺藍染色以及免疫組化BMP2檢測,。
從轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑或其陰性對照Mock的培養(yǎng)了48 h BMSCs中提取EVs,并在骨折后第1天和第8天對WT和CD9-/-骨折小鼠進行處理,；
（A）EV治療后0、1,、2和4周WT和CD9-/-骨折小鼠的代表性放射學(xué)圖像,。（B）HE染色、甲苯胺藍染色,、BMP2的免疫化學(xué)觀察EVs抑制劑治療WT和CD9-/-骨折小鼠股骨骨折愈合情況,。（C）RT-qPCR和（D）western blot分析測定骨折后2周小鼠股骨α-SMA、OCN,、GDF-10,、FGF-2的mRNA和蛋白水平。
第三部分：microRNA-335通過囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway,，Wnt/β-catenin）促進骨折恢復(fù),。1.通過MTT檢測成骨細胞樣細胞MC3T3和MG63的活力、Tunel及Alizarin red檢測成骨細胞樣細胞MC3T3和MG63細胞凋亡,。2. 堿性磷酸酶染色檢測培養(yǎng)的小鼠骨細胞,，使用AP染色液進行染色，使用光學(xué)顯微鏡對紅染細胞集落與無色集落進行計數(shù),，熒光顯微鏡下觀察細胞,；3. 依據(jù)Lipofectamine 2000的說明書，將質(zhì)粒分別與mimic NC或mimic miR-335共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,。使用Dual-Glo®雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-335和VapB之間的結(jié)合關(guān)系,；4. RNA pull down檢測蛋白作用關(guān)系，使用識別RBP的一抗來檢測目標RBP與適當?shù)牡诙贵w一起孵育以識別第一抗體,，并使用增強型化學(xué)發(fā)光檢測信號；
本部分研究結(jié)果：1. MTT方法檢測了成骨細胞MC3T3和MG63細胞的增殖率,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVs的處理促進了細胞增殖,。TUNEL染色結(jié)果顯示，EV處理可抑制細胞凋亡,；2. F-actin的免疫熒光染色觀察了MC3T3和MG63細胞的細胞粘附,，發(fā)現(xiàn)B-EV處理對細胞粘附無明顯影響,；3. 人I型膠原蛋白（Human type I collagen，ColⅠ）的免疫熒光染色證明B-EVs促進ColⅠ表達,，與茜素紅染色結(jié)果一致,。RT-qPCR和western blot分析驗證B-EV處理可增加α-SMA、OCN,、GDF-10和FGF-2的水平,；4. RT-qPCR顯示EVs-Inhibitor處理后miR-335表達明顯下降，并伴有細胞增殖率的下降和細胞凋亡的增加,。而且,，ALP、茜素紅和ColⅠ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),，B-EVs攜帶的miR-335的干預(yù)部分抵消了B-EVs對MC3T3和MG63細胞成骨細胞分化的促進作用,；5. 囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促進破骨細胞的生長，因此我們重點研究了VapB,，HEK293T細胞中的雙熒光素酶報告基因檢測顯示miR-335可以靶向VapB,；6. RT-qPCR和western blot分析檢測小鼠和細胞中VapB水平。結(jié)果顯示,，EV處理抑制了VapB水平,，而miR-335抑制可以緩解VapB的抑制；7. miRwalk,、TargetScan,、EvimcrRNA和Starbase的網(wǎng)站上預(yù)測并篩選了miR-335的7個靶基因（SMARCA2、VAPB,、NAA25,、KLHL28、NUCKS1,、RCC2和RBFOX2）,，通過文獻調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促進破骨細胞的生長,。使用RT-PCR和western blot鑒定過表達VapB細胞的構(gòu)建情況,，RT-qPCR顯示，轉(zhuǎn)染后細胞中VapB mRNA的表達明顯增加,，使用western blot在蛋白中觀測到了相似結(jié)果,；MTT檢測細胞活力及TUNEL染色檢測細胞凋亡的結(jié)果表明，過表達VapB細胞的細胞伴有細胞增殖率的下降和細胞凋亡的增加,，表明VapB過表達誘導(dǎo)細胞凋亡,；VapB過表達部分抵消了B-EVs對MC3T3和MG63細胞成骨細胞分化的促進作用。8. 過表達VapB可逆轉(zhuǎn)EVs對Wnt和β-catenin蛋白表達的促進,。提示EVs中靶向VapB的miR-335可能與Wnt和β-catenin通路有關(guān),。
從轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑或Mock的培養(yǎng)了48h的BMSCs中提取EVs,，并作用于MC3T3和MG63細胞24h
（A,B）：MTT法測定MC3T3和MG63細胞活力。（C）TUNEL染色測定MC3T3和MG63細胞凋亡,。（D）采用ALP法測定MC3T3和MG63細胞ALP活性,。（E）茜素紅染色驗證MC3T3和MG63骨分化能力。（F）免疫熒光染色測定細胞ColⅠ的表達,；（G,、H）RT-qPCR和western blot檢測測定α-SMA、OCN,、GDF-10,、FGF-2的mRNA和蛋白水平。
miR-355靶向作用VapB
（A）RNA pull-down實驗驗證MC3T3和MG63細胞中miR-335與VapB的結(jié)合,。（B,，C）通過RT-qPCR和western blot分析測定骨折小鼠模型或MC3T3和MG63細胞（D、E）中VapB mRNA和蛋白水平,。
B-EVs攜帶的miR-335靶向VapB,，通過激活Wnt/β-catenin通路促進骨折恢復(fù)。（A,，B）Western blot分析測定骨折小鼠股骨及MC3T3,、MG63細胞Wnt/β-catenin相關(guān)蛋白水平。
